如何把控HE染色及常见问题分析

HE染色（Hematoxylin and Eosin staining是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。用于在显微镜下观察和分析组织或细胞的结构

和形态。这种方法对组织细胞的各种成分都可着色，经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细

胞核等着色。被苏木素着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性.伊红是酸性染料，粉红色。可以将大多数细胞的细胞质染成红色。被伊红着色的结构本身为碱性，具有嗜

酸性.

HE染色需要注意事项

1.组织固定

组织样本必须立即并充分固定，以防止处理过程中组织细胞的破坏。用10%缓冲福尔马林进行固定通常是一个比较好的选择。

2.切片制备

对于组织样本的切片厚度应该是均匀的，并且不能太薄或太厚。一般来说，3-4微米是一个常见的厚度。

3.pH值调节

染色时调节pH值很重要。在染色期间pH值应始终稳定。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理,这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

4.控制分化时间

切片染苏木精后，分化这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清晰而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

5.彻底脱去酒精

组织切片需要通过一系列的酒精浓度逐渐脱水，并用透明剂二甲苯进行透明化。透明化后切片会变得更加清晰，便于染色。切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，彻底脱水与透明。

6.保持切片的湿润

在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

7.封片注意事项

最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

8.洗涤

洗涤步骤很重要。未充分清洗会导致染色剂残留，影响结果的质量。每个处理步骤后，应该彻底洗涤干净。

9.避免空气暴露

空气中的灰尘和污染物会对实验产生不利影响，因此在染色过程中，需要避免将切片长时间暴露在空气中，并保持实验室的清洁和卫生。

10.监控染色反应

染色的过程应该密切监测，以便在必要时进行微调。需要管理好每个步骤的时间和温度，以避免过度染色或染色不足的情况发生。

HE染色常见问题与解决方法

切片在脱蜡后出现大片白色的斑点可能原因：

（1)烤（烘）片温度太低，玻片在脱蜡前没有充分烤（烘）干；（2)切片在二甲苯停留时间不足；（3)二甲苯使用过久，造成脱蜡不完全。解决方法：如果玻片是由于没有烤（烘）干，先用无水乙醇处理去除玻片上的水分，然后重新用二甲苯进行脱蜡处理。如果烤（烘）干不足的现象比较严重，可能导致切片脱落，则无法补救需要重新切片。如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成，或使用的二甲苯过久，切片则需退回到二甲苯操作步骤，使其停留时间相对长些，或更换二甲苯，进行重新染色。

结构不清晰或模糊原因及解决方法：

这可能是由于切片质量不良或染色条件不佳引起的，因此需要检查并排除这些因素。另外，透明化处理后切片时若没有完全除去异物或固定较差，也可能导致结构不清晰或模糊的问题。

细胞核染色暗淡，即苏木精染色太淡原因：

（1)切片在苏木精染色液停留时间太短；（2)苏木精染色液过度氧化，失去染色能力，不能再继续使用需要更换新的苏木素；（3)分化步骤处理时间过长。如果是骨组织细胞核暗淡，则多数是由于脱钙过度造成。解决方法：

切片重新染色。如果组织在固定液固定时间过长，细胞核染色能力将减弱，须增加其在苏木精染色液的时间，或用一些方法增加组织的嗜碱性，以改善细胞核的着色。

细胞核呈红、棕色改变原因：

苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。解决方法：首先，每次染色之前检查苏木精染色液的染色能力，发现氧化过度应及时更换。其次，可用流水、温水或弱碱性溶液等进行反蓝，在苏木精染色后，给切片以足够的蓝化时间。

伊红着色淡原因：

（1)伊红染液的pH值可能大于5;（2)蓝化液残留过多；（3)切片太薄；（4)切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。解决方法：

检查伊红染液的pH值，如果必要的话，用乙酸将其调节在4~5之间，从而使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化步骤完成后，使用的弱碱性溶液被充分洗去，玻片上没有残留的弱碱性溶液。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长，因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。

显微镜下见切片内有大量水珠原因：

切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水，导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。解决方法：移去盖玻片，用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇中，待切片重新脱水完全后，用新二甲苯透明，中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间以后，应即时更换。

细胞质染色过深原因：

（1)伊红染色液浓度太高，特别是焰红燃料、四溴四氯荧光素钠的存在；（2)切片在伊红染色时间过长；（3)切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快，而使乙醇分化伊红的作用不能产生。解决方法：适当稀释伊红染色液，减少伊红染色时间，或者使切片在乙醇脱水等步骤时，停留时间相对均匀。同样，也要检查切片的厚度是否合适。

染色过淡或过浓处理方法：

如果染色过淡，可以增加染色剂的浓度、延长染色时间或更换新鲜的染色剂；如果染色过浓，则应减少染色剂的浓度或缩短染色时间。

色彩失真处理方法：

在染色过程中，应尽量遵守操作规程和注意事项，以确保染色效果的稳定性和可靠性。通过控制溶液浓度、温度和处理时间等参数来优化染色过程，可以帮助解决色彩失真的问题。

细胞核灰蓝原因：

（1)组织处理温度过高、过热，在石蜡停留的时间过长；（2)固定时间太短，接下来就直接在高浓度的乙醇中行脱水处理。处理方法：理论上来说，加热处理仅在组织浸蜡步骤才使用，组织不能在热的蜡液中停留过长时间。如果由于某些原因不能进行下步包埋处理，完成浸蜡处理后的组织，可将组织连同塑料包埋盒一并放置在室温空气中，冷却凝固，以备包埋。待需要包埋时再重新加温直至石蜡融化即可。组织在处理前必须确保固定良好，脱水最好能从低浓度的乙醇开始。

总结：进行HE染色实验时，需要密切监测染色过程，及时发现并处理任何可能引起问题的问题。如果出现染色异常，应该检查实验条件和实验步骤，并采取相应的纠正措施，以确保染色结果的质量和可靠性。